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10x Genomics空間轉錄組測序
背景介紹
基因(yin)表(biao)達具有時(shi)間(jian)(jian)特異性(xing)和(he)空(kong)間(jian)(jian)特異性(xing)。時(shi)間(jian)(jian)特異性(xing)通常(chang)(chang)(chang)可以通過對不同時(shi)間(jian)(jian)點的樣(yang)本取(qu)材，再使(shi)用(yong)單細胞(bao)(bao)轉錄(lu)組(zu)測(ce)序(xu)技術來進行(xing)解析。然而(er)，空(kong)間(jian)(jian)特異性(xing)信(xin)息常(chang)(chang)(chang)常(chang)(chang)(chang)難(nan)以獲(huo)得。常(chang)(chang)(chang)規轉錄(lu)組(zu)測(ce)序(xu)和(he)單細胞(bao)(bao)轉錄(lu)組(zu)測(ce)序(xu)無法還原(yuan)細胞(bao)(bao)所處的原(yuan)始位置(zhi)信(xin)息，而(er)傳統的原(yuan)位雜交技術又很難(nan)實現高(gao)通量檢測(ce)。 10x Genomics Visium空(kong)間(jian)(jian)轉錄(lu)組(zu)技術，可在組(zu)織(zhi)原(yuan)位以超高(gao)分辨率(lv)研(yan)究(jiu)基因(yin)表(biao)達特征(zheng)和(he)空(kong)間(jian)(jian)分布(bu)。此外(wai)，結(jie)合單細胞(bao)(bao)轉錄(lu)組(zu)和(he)空(kong)間(jian)(jian)轉錄(lu)組(zu)進行(xing)聯(lian)合研(yan)究(jiu)，可使(shi)空(kong)間(jian)(jian)位置(zhi)的基因(yin)表(biao)達研(yan)究(jiu)深入(ru)到超高(gao)分辨率(lv)的單細胞(bao)(bao)層次(ci)，對于癌癥、免疫(yi)、神(shen)經、發(fa)育等領域(yu)，有著(zhu)令人期待的應(ying)用(yong)前景。
不(bu)同層(ceng)面(mian)轉錄(lu)組研究
技術原理
對新(xin)(xin)鮮(xian)(xian)冷(leng)(leng)凍組(zu)(zu)(zu)織(zhi)(zhi)或(huo)FFPE組(zu)(zu)(zu)織(zhi)(zhi)進行(xing)包(bao)埋和切(qie)片(pian)(pian)，并將其放(fang)置(zhi)在基因(yin)表(biao)(biao)達(da)玻(bo)(bo)片(pian)(pian)上的(de)(de)(de)(de)(de)(de)捕獲區(qu)內（新(xin)(xin)鮮(xian)(xian)冷(leng)(leng)凍組(zu)(zu)(zu)織(zhi)(zhi)需先摸索(suo)組(zu)(zu)(zu)織(zhi)(zhi)切(qie)片(pian)(pian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)目標(biao)區(qu)域(yu)(yu)透(tou)化(hua)條件(jian) , 以(yi)便確定(ding)透(tou)化(hua)最佳條件(jian)）。基因(yin)表(biao)(biao)達(da)芯片(pian)(pian)有4個點陣(zhen)區(qu)域(yu)(yu)（6.5mmx6.5mm） ，每(mei)個點陣(zhen)均含有4,992個 barcoded spot（直徑為55 μm），每(mei)個spot有一個獨(du)特條形(xing)碼序(xu)(xu)列用(yong)于位置(zhi)定(ding)位。進行(xing)H&E染色后(hou)，在明場顯微(wei)鏡(jing)下(xia)觀察(cha)玻(bo)(bo)片(pian)(pian)上的(de)(de)(de)(de)(de)(de)組(zu)(zu)(zu)織(zhi)(zhi)切(qie)片(pian)(pian)，之后(hou)對組(zu)(zu)(zu)織(zhi)(zhi)進行(xing)透(tou)化(hua)處(chu)理，以(yi)釋放(fang)出(chu)細胞中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)mRNA（新(xin)(xin)鮮(xian)(xian)冷(leng)(leng)凍組(zu)(zu)(zu)織(zhi)(zhi)）或(huo)連接(jie)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)探針對（FFPE組(zu)(zu)(zu)織(zhi)(zhi)） 。這些mRNA或(huo)探針對與(yu)spot上帶(dai)有空間(jian)條形(xing)碼的(de)(de)(de)(de)(de)(de)寡核苷酸(suan)相(xiang)結合(he)。通過(guo)生成(cheng)cDNA的(de)(de)(de)(de)(de)(de)逆轉錄反應（新(xin)(xin)鮮(xian)(xian)冷(leng)(leng)凍組(zu)(zu)(zu)織(zhi)(zhi)）或(huo)延長(chang)反應（ FFPE組(zu)(zu)(zu)織(zhi)(zhi)）引入空間(jian)條形(xing)碼。將帶(dai)有條形(xing)碼的(de)(de)(de)(de)(de)(de)分子混合(he)后(hou)進行(xing)下(xia)游處(chu)理，制備出(chu)立即(ji)可測(ce)序(xu)(xu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)文(wen)庫。生成(cheng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)10x條形(xing)碼文(wen)庫與(yu)Illumina測(ce)序(xu)(xu)儀上的(de)(de)(de)(de)(de)(de)標(biao)準短讀長(chang)NGS測(ce)序(xu)(xu)兼容，能(neng)夠實現整(zheng)張組(zu)(zu)(zu)織(zhi)(zhi)切(qie)片(pian)(pian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)大(da)規(gui)模轉錄分析。測(ce)序(xu)(xu)數(shu)據中(zhong)空間(jian)條形(xing)碼序(xu)(xu)列將轉錄信息映射回組(zu)(zu)(zu)織(zhi)(zhi)切(qie)片(pian)(pian)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)起始位置(zhi)，從而(er)還(huan)原轉錄本在組(zu)(zu)(zu)織(zhi)(zhi)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)位置(zhi)分布，實現基因(yin)表(biao)(biao)達(da)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)空間(jian)可視(shi)化(hua)。
Visium空間(jian)基因表達玻片的組成
注： 每(mei)張玻片包含2個(ge)或4個(ge)捕(bu)獲區，每(mei)個(ge)捕(bu)獲區含有(you)約(yue)5,000個(ge)帶有(you)條形碼(ma)的(de)數(shu)據點(dian)，而每(mei)個(ge)數(shu)據點(dian)又包含數(shu)百萬條帶空間條形碼(ma)的(de)捕(bu)獲寡核(he)苷酸。組織mRNA在(zai)釋(shi)放(fang)后與這些寡核(he)苷酸結(jie)合(he)，可實現(xian)基因表(biao)達(da)信(xin)息的(de)捕(bu)獲。
Visium空間基因表達的流程(cheng)圖
注： 對(dui)新鮮冷凍組織或FFPE組織進行(xing)(xing)切片(pian)，并(bing)(bing)將其放置在文(wen)庫(ku)制(zhi)備(bei)玻片(pian)上，然(ran)后(hou)進行(xing)(xing)固定，通(tong)過H&E或免疫熒(ying)光(guang)（IF） 染色并(bing)(bing)成像(xiang)，接(jie)著添(tian)加(jia)空間(jian)條形碼并(bing)(bing)構建文(wen)庫(ku)。對(dui)制(zhi)備(bei)好的文(wen)庫(ku)進行(xing)(xing)測序(xu)，并(bing)(bing)對(dui)數據進行(xing)(xing)可視化(hua)。
結果展示
分群可視化結果（左）；Spots分群圖（中）；Marker基因表達熱圖（右）
亞(ya)群(qun)聚類熱圖(tu)（左）；基因Term關系網絡(luo)圖(tu)（中）；GSEA富(fu)集分析（右(you)）
產品優勢
雙重(zhong)信息
實現基因表達(da)數據與(yu)空間(jian)定(ding)位信息(xi)的結合，解析多(duo)種類型組織切(qie)片樣(yang)本中基因表達(da)譜；
分辨(bian)率高
每個芯片點(dian)陣(zhen)包含近5,000個spot，每個spot平均分辨率為1至(zhi)10個細胞，可(ke)以檢測幾千(qian)個基因；
結果無(wu)偏
無需組織解離，保(bao)留(liu)組織結構及細(xi)胞(bao)微(wei)環境，鑒定異(yi)質性組織中細(xi)胞(bao)類(lei)型；特(te)殊UMI設計，避免反轉錄偏好性，降低(di)誤差；
FFPE兼容
突破從FFPE（石蠟包埋）組(zu)織中獲取空間基因表達(da)信息的障礙；
平臺完善
具有冷凍切片機、超高分辨率顯微鏡、 10x Genomics Visium等服務平臺；
團(tuan)隊(dui)專(zhuan)業
中科院博士帶領專業實驗(yan)團隊。現已累積50余種不(bu)同組織類(lei)型、數百余個樣(yang)品的(de)空(kong)間轉(zhuan)錄組實驗(yan)經驗(yan)。
送樣要求
與單細胞聯合分析
單(dan)細(xi)胞(bao)轉錄(lu)組(zu)測(ce)序能很好的揭示(shi)(shi)了(le)組(zu)織異質性，但由于獲取細(xi)胞(bao)懸液時(shi)對(dui)組(zu)織進(jin)行(xing)了(le)酶解，從而(er)導致組(zu)織空(kong)間位置(zhi)信(xin)息(xi)(xi)丟失。而(er)空(kong)間轉錄(lu)組(zu)測(ce)序技(ji)術可以同(tong)時(shi)提供空(kong)間位置(zhi)信(xin)息(xi)(xi)和基因表達信(xin)息(xi)(xi)，但檢(jian)測(ce)的單(dan)位不是單(dan)細(xi)胞(bao)水平，綜(zong)合運用單(dan)細(xi)胞(bao)檢(jian)測(ce)技(ji)術和空(kong)間轉錄(lu)組(zu)檢(jian)測(ce)技(ji)術將兩(liang)種檢(jian)測(ce)結(jie)果進(jin)行(xing)聯合分析，對(dui)空(kong)間轉錄(lu)組(zu)的檢(jian)測(ce)結(jie)果進(jin)行(xing)精(jing)(jing)確的細(xi)胞(bao)類型注釋，從而(er)在不同(tong)應用場景中更(geng)加精(jing)(jing)準的揭示(shi)(shi)細(xi)胞(bao)相互(hu)作(zuo)用和組(zu)織理解。
空間轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)組(zu)(zu)和單細胞轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)組(zu)(zu)整(zheng)合(he)研究應用場(chang)景
應用方向
腫(zhong)瘤(liu)研究： 腫瘤(liu)微環境、腫瘤(liu)異質(zhi)性；
免疫(yi)研究(jiu)： 免(mian)疫微環(huan)境(jing)；
發育生(sheng)物學(xue)： 細胞類(lei)型(xing)的空間分布(bu)、時(shi)空變(bian)化(hua)；
腦神經學： 神經系統(tong)研究、腦圖譜構建；
病理(li)學： 病例切片的(de)空間基因表達(da)信息；
細胞圖(tu)譜： 構(gou)建三維空間圖譜。
應用案例
單細胞分辨率下人類腸道發(fa)育(yu)的時空分析(xi)
Spatiotemporal analysis of human intestinal development at single-cell resolution
發表(biao)雜志： Cell（IF: 41.582）； 發表時間： 2021年 2月； 應用(yong)技術： 10x Genomics單細胞轉錄(lu)組測序， 10x Genomics空(kong)間轉錄(lu)組測序
本研(yan)究將(jiang)單細(xi)胞(bao)(bao)轉錄(lu)組測序(xu)和(he)(he)空間轉錄(lu)組測序(xu)進行聯合，繪制(zhi)了(le)隨時間變(bian)化的(de)(de)腸(chang)(chang)道(dao)形(xing)(xing)態發(fa)(fa)生。確(que)定了(le)101個細(xi)胞(bao)(bao)狀態，包括上皮細(xi)胞(bao)(bao)和(he)(he)間充(chong)質祖細(xi)胞(bao)(bao)群(qun)以(yi)及與關鍵形(xing)(xing)態發(fa)(fa)生相(xiang)(xiang)關的(de)(de)重要階(jie)段過程(cheng)。描述(shu)了(le)隱窩-絨毛軸形(xing)(xing)成的(de)(de)原理，神(shen)經、血管、間充(chong)質形(xing)(xing)態發(fa)(fa)生和(he)(he)腸(chang)(chang)道(dao)的(de)(de)免(mian)疫(yi)種群(qun)，鑒定了(le)發(fa)(fa)育中的(de)(de)成纖(xian)維(wei)細(xi)胞(bao)(bao)和(he)(he)肌纖(xian)維(wei)細(xi)胞(bao)(bao)亞型(xing)的(de)(de)分(fen)化層(ceng)次，并闡述(shu)了(le)它(ta)們的(de)(de)不同功能。明(ming)確(que)了(le)佩爾斑和(he)(he)腸(chang)(chang)道(dao)相(xiang)(xiang)關淋巴組織(zhi)的(de)(de)起源(yuan)，并描述(shu)了(le)位(wei)置特(te)異性(xing)免(mian)疫(yi)程(cheng)序(xu)。本研(yan)究使用這(zhe)一(yi)(yi)資源(yuan)來(lai)呈(cheng)現了(le)形(xing)(xing)態發(fa)(fa)生梯度的(de)(de)無偏分(fen)析(xi)，這(zhe)一(yi)(yi)梯度能夠(gou)指(zhi)導細(xi)胞(bao)(bao)分(fen)化的(de)(de)連(lian)續(xu)波并定義與罕見發(fa)(fa)育性(xing)腸(chang)(chang)道(dao)疾(ji)病相(xiang)(xiang)關的(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)和(he)(he)位(wei)置，匯編(bian)了(le)一(yi)(yi)個公開可(ke)用的(de)(de)在(zai)線資源(yuan)，即(ji)胎兒腸(chang)(chang)道(dao)發(fa)(fa)育的(de)(de)時空分(fen)析(xi)資源(yuan)（STAR-FINDer），以(yi)期促(cu)進后續(xu)的(de)(de)相(xiang)(xiang)關研(yan)究工作。
腸發(fa)育圖譜研究(jiu)技術路(lu)線
空(kong)間轉錄組(zu)和(he)單(dan)細胞轉錄組(zu)測序整合(he)對腸道發育(yu)的時(shi)空(kong)分析(xi)
