發布日期：2022-05-06 15:17:52
Single-cell landscape of immunological responses in patients with COVID-19
2020年7月，Nature Immunology 發表了關于新冠病人免疫反應的單細胞全景圖譜研究，該研究利用10X單細胞轉錄組測序+單細胞TCR&BCR免疫組庫測序技術，對5個健康人和13和新冠患者的PBMC樣本測序分析。通過確定免疫細胞的轉錄譜，結合組裝好的T細胞受體和B細胞受體序列，分析免疫細胞的功能特性。COVID-19患者的大多數細胞類型顯示出強烈的干擾素-α反應和整體急性炎癥反應。此外，高細胞毒性效應T細胞亞群的密集擴張，如CD4+效應因子-gnly 、CD8+效應因子-gnly和NKT CD160，與中度患者的康復相關。在重癥患者中，免疫系統的特點是干擾素反應紊亂，嚴重的免疫衰竭，扭曲的T細胞受體庫和廣泛的T細胞擴張。這些發現提示了疾病進展過程中免疫反應的動態性質。
一. 研究(jiu)背(bei)景及意義(yi)
在新冠肺炎(yan)中(zhong)，疾(ji)(ji)(ji)病(bing)嚴(yan)重程度與宿主免疫應答之間(jian)的關(guan)系尚(shang)不完全清(qing)楚。研究描繪了在COVID-19疾(ji)(ji)(ji)病(bing)進展過(guo)程中(zhong)血液免疫細胞的高分辨率(lv)轉錄(lu)情況，這將有助于(yu)更好(hao)地(di)理解疾(ji)(ji)(ji)病(bing)的保護(hu)性(xing)和致病(bing)性(xing)免疫反應。
二. 樣本(ben)
5個(ge)(ge)健康人(ren)、13個(ge)(ge)患者(中度(du)7,重度(du)4和恢(hui)復(fu)期6，有4個(ge)(ge)與(yu)中度(du)的配對），PBMC
三(san). 技(ji)術
10X單細胞轉錄組測序+單細胞TCR&BCR免疫組庫測序
四(si).結論
1.外周血(xue)免疫細(xi)胞(bao)的單細(xi)胞(bao)表達譜概述
繪(hui)制(zhi)了(le)122,542 個單細(xi)胞(bao)聚類(lei)(lei)(lei)圖，14個細(xi)胞(bao)類(lei)(lei)(lei)型(xing)及各類(lei)(lei)(lei)型(xing)的marker基因的在整體中的表達情況。明確了(le)外周血細(xi)胞(bao)的組成。
2.不同疾病狀態下細胞組(zu)成的差異
2.1 為了揭(jie)示中(zhong)度、重度和(he)恢(hui)復期新(xin)冠肺(fei)炎患者與健(jian)康人相比細胞組成(cheng)的差(cha)異，該研究對每個(ge)樣本的14個細(xi)胞(bao)(bao)類型的相對比(bi)例進行計(ji)算。在(zai)中(zhong)度(du)(du)患(huan)者(zhe)中(zhong)，活(huo)化的T細(xi)胞(bao)(bao)群的相對百(bai)分比(bi)達到峰(feng)值，即使(shi)在(zai)恢復(fu)(fu)期也沒有恢復(fu)(fu)到正(zheng)常(chang)水平；幼稚T細(xi)胞(bao)(bao)、MAIT細(xi)胞(bao)(bao)和mono DCs的相對豐度(du)(du)隨著(zhu)疾病的嚴(yan)重程度(du)(du)而下降，這(zhe)些群體后來在(zai)恢復(fu)(fu)期患(huan)者(zhe)中(zhong)恢復(fu)(fu)。
2.2 接下(xia)來，為了研究COVID-19感染(ran)期間(jian)的抗病毒和(he)病原性(xing)免疫應答(da)，該團隊(dui)評(ping)估了兩(liang)個重要通路的表達水平(ping)。發現兩(liang)條GO通路在(zai)疾(ji)病中顯(xian)著高表達：干擾素(IFN)-α反(fan)應與急性炎癥反(fan)應。在COVID-19患者的pbmc中，IFN-α的(de)應答在所(suo)有(you)主要(yao)細胞類(lei)型(xing)中(zhong)均一致且顯著上調(diao)，在重癥患者(zhe)中(zhong)幾乎所(suo)有(you)主要(yao)細胞類(lei)型(xing)的(de)應答均最高（除血漿B細胞在中度患(huan)者的IFN-α反應(ying)最大(da)(da)外）。幾種細胞類型在急性炎(yan)癥反應(ying)中表現出(chu)大(da)(da)致與疾病嚴(yan)重程度相對應(ying)的趨勢，包括(kuo)活化T細胞、γδ T細(xi)胞(bao)、NK細胞和CD16+單核細胞。
這(zhe)些結果表(biao)明COVID-19患者(zhe)存在(zai)強烈的整(zheng)體促炎癥反應。
3.在(zai)天然免疫細胞中觀察到強烈的干擾素反應(ying)
進一步研究(jiu)感染(ran)COVID-19之后的(de)先天(tian)免疫細胞(bao)的(de)轉錄組(zu)學變化，該團隊比較了CD14+和CD16+單核(he)細胞在(zai)中度/重度與健康(kang)狀態下(xia)的(de)(de)表達達情況。發現顯著差(cha)異(yi)表達的(de)(de)基因參與了COVID-19患者的IFN反應、髓樣白細胞激活、細胞因子產生和(he)NF-κB信(xin)號(hao)通路。
這(zhe)些結(jie)果表明，COVID-19患(huan)者的(de)大多數先天免疫細胞(bao)類型顯示出強烈的(de)IFN反應。
4.COVID-19患者(zhe)T細(xi)胞亞群表(biao)達特點
4.1 為了探(tan)究四(si)種情況(kuang)下個體間T細(xi)胞亞群的變化，研究者將(jiang)PBMCs中的T細(xi)胞進一步分群，根據經典T細胞標記物的表達和(he)分(fen)布共獲得了12個亞(ya)群(qun)：包(bao)括(kuo)CD4+ T細(xi)(xi)胞(bao)(CD3E+CD4+)的6種亞(ya)型、CD8+ T細(xi)(xi)胞(bao)的3種亞(ya)型(CD3E+CD8A+)和3種NKT細(xi)(xi)胞(bao)亞(ya)型(CD3E + CD4-CD8A-TYROBP +)。
4.2 在CD4+ T細(xi)(xi)胞(bao)的6個亞(ya)型(xing)中，除了(le)naive CD4+ (CD4+ naive) T 細(xi)(xi)胞(bao)(CCR7+SELL+), memory CD4+ (CD4+ memory) T 細(xi)(xi)胞(bao)(S100A4+GPR183+), effector memory CD4+ (CD4+ effector memory) T 細(xi)(xi)胞(bao) (S100A4+GPR183+GZMA+) 和(he) regulatory T (Treg) cell (FOXP3+IL2RA+) 亞(ya)型(xing)，該研究還定義了(le)兩種新的CD4+效(xiao)應T細(xi)(xi)胞(bao)亞(ya)型(xing)：CD4+ effector-GZMK and CD4+ effector-GNLY，后者高表(biao)達(da)細(xi)(xi)胞(bao)毒(du)性(xing)相關(guan)基因(yin)(yin)如(ru)NKG7, GZMA, GZMB, GZMH 和(he)GNLY，而(er)前者高表(biao)達(da)GZMK基因(yin)(yin)且低表(biao)達(da)其他細(xi)(xi)胞(bao)毒(du)性(xing)相關(guan)基因(yin)(yin)。
4.3 為了深入了解(jie)T細胞亞群的(de)(de)特(te)征(zheng)，研究者評估(gu)了(le)在四種情況(kuang)下每個亞群的(de)(de)分布情況(kuang)。值得(de)注意的(de)(de)是，與HDs相比，COVID-19患者(zhe)中CD4+ naive、CD4+ memory、CD4+ effec- tor memory、Treg、CD8+ naive和NKT naive等naive狀態T細胞亞群比例下降。即使(shi)在恢復期，CD4+初(chu)發、CD8+初發(fa)和(he)Treg的比(bi)例也沒(mei)有恢復到HDs的(de)水平。相(xiang)比之下，COVID-19患者中(zhong)活動狀態T細胞亞群(包括CD4+效應- gnly、CD8+效應- gnly、NKT CD56和(he)NKT CD160亞群)的(de)比例增加，即使(shi)在conv患者中(zhong)，這(zhe)些細胞毒性亞(ya)群的(de)(de)比例也很(hen)高。特別值得注意的(de)(de)是，CD4+ effector-GNLY亞(ya)群在HDs中(zhong)幾乎不存在(zai)，但(dan)在(zai)中(zhong)、重(zhong)度和conv患者中高度(du)富集。此外，與中度(du)患者相比，重度(du)患者NKT CD160亞群的(de)豐(feng)度明顯降低。
4.4 然后，研(yan)究者評估了四種條件下不同效應態T細(xi)胞(bao)亞群的細(xi)胞(bao)毒性和(he)衰竭(jie)評分(fen)。CD4+ effector-GNLY、CD8+ effector-GNLY、NKT CD56和NKT CD160亞(ya)群的細(xi)胞毒性評分(fen)高于其他亞(ya)群。在這些具有高度細(xi)胞毒性的亞(ya)群中，除了CD4+ effector-GNLY亞群(qun)外，HDs的細(xi)胞毒(du)性評分最低，而中等水平的情況顯示出最高的細(xi)胞毒(du)性狀(zhuang)態。CD4+ effector-GZMK、CD8+ effector-GZMK和(he)NKT CD160組較其(qi)他亞(ya)(ya)群表(biao)現出更高的(de)(de)衰竭評分。在(zai)這些高度衰竭的(de)(de)亞(ya)(ya)群中，HDs都(dou)有(you)最低的(de)(de)衰竭得分，而重度患者表(biao)現出最衰竭的(de)(de)狀態。
4.5 為了進(jin)一步研究COVID-19感染(ran)后T細胞轉錄(lu)組的差異(yi)變(bian)化，研究者比較了效應T細(xi)胞(bao)(不包括CD4+ naive、CD4+ memory、CD8+ naive和NKT naive亞(ya)群)在中度(du)、重度(du)和HD患(huan)者中的表(biao)達譜。 發現COVID-19患(huan)者(zhe)中表達上調的(de)差異基(ji)因參與了(le)包括IFN，細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)因子的產生(sheng)，細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)殺傷，白細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)粘附和細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)骨架組織等(deng)在內的過程。此外，使用凋亡和遷(qian)移評(ping)分(fen)系(xi)統，觀(guan)察到嚴重患者的T細胞可(ke)能經歷(li)了遷移和凋亡。重癥(zheng)患者PBMC中細(xi)胞死亡和遷移途徑的顯著(zhu)激活提(ti)示，細(xi)胞死亡和淋巴細(xi)胞遷移可能與淋巴細(xi)胞減少有關，這是重癥(zheng)COVID-19患者常見的(de)現(xian)象。
5.在COVID-19患者中T細胞的克隆擴增和(he)V(D)J基(ji)因的首選使用
5.1 接(jie)下來，為了(le)深入了(le)解(jie)單(dan)個T細胞之(zhi)間的(de)克隆關系和V(D)J基(ji)因在四種情況(kuang)下(xia)的使用情況(kuang)，研(yan)究者從TCR測序中重建了TCR序列。簡單地說，除三個NKT亞群外(wai)，所有(you)亞群中有(you)超(chao)過70%的(de)細胞具有匹配的(de)TCR信息。首先(xian)，與HDs相比，克隆擴(kuo)增在COVID-19患者和(he)恢(hui)復期(qi)患者中表現明顯；克(ke)隆擴增在(zai)中度(du)(du)和(he)恢(hui)復期(qi)的(de)程度(du)(du)高于重度(du)(du)期(qi)，同時，在(zai)嚴重的(de)情況下，沒有(you)大量的(de)克(ke)隆擴增(克隆(long)大(da)小>100)，提示重癥患者可能缺乏有(you)效的效應T細胞克(ke)隆擴(kuo)增。研(yan)究者觀察到T細胞亞群之間有不同程(cheng)度(du)的克隆擴(kuo)增。
5.2 為了研究COVID-19和HDs患者(zhe)TCRs的動態(tai)和基因偏好，我們比較了四種情況(kuang)下V(D)J基因的使用情況。前10位CDR3序列在(zai)4種條件下均(jun)有(you)差異(yi)。值得(de)注意的(de)是，研究者發現了V(D)J基因在COVID-19患(huan)者中的不同用法，多樣性降低，尤其是在TRA基因中(zhong)更為明(ming)顯。研(yan)究(jiu)者(zhe)還發(fa)現與中(zhong)度和恢復期患(huan)者(zhe)相比，重度患(huan)者(zhe)中(zhong)TRAJ39和(he)TRAJ43的表達較高。重度患(huan)者首選TRBJ基因(yin)為TRBJ1-1，而中度(du)和非重度(du)患(huan)者首選(xuan)TRBJ2-1。V(D)J基(ji)因的選擇性使用表明，不同(tong)的免疫優勢表位可能驅動T細胞反應的分子組成(cheng)，并可能與SARS-CoV- 2特異性感染有(you)關。
6. COVID-19患者B細胞亞群(qun)特征
為了追蹤不(bu)同B細胞(bao)亞型的動(dong)態變化，研究者根據典型B細胞標記物(wu)的表達(da)和分布將B細胞分為6個亞(ya)群：一個naive B亞(ya)群集(ji)(MS4A1+IGHD+)，一個(ge)memory B亞群(MS4A1+CD27+)，一個intermediate memory B 亞群(IGHD+CD27+ ），1個(ge)germinal center B 亞群(MS4A1+NEIL1+)和2個(ge)plasma亞群：plasma B (MZB1+CD38+)和dividing plasma B (MZB1+ CD38+MKI67+) 。值得注意的是，COVID-19患(huan)者活躍(yue)狀態B亞群(qun)(包括生發中心B、血漿B和血漿(jiang)B分裂亞群)的比例比HDs患(huan)者增加。與HDs相(xiang)比，COVID-19患者的記憶B細胞比例下降。
為了進(jin)一步研究(jiu)SARS-CoV-2感染后B細胞轉錄組的(de)差異(yi)變化，我們(men)比較了(le)中重度和(he)HD患者(zhe)B/漿細胞的表達(da)譜。COVID-19患者中最顯著富集的差(cha)異(yi)基因涉及(ji)與IFN反應相關(guan)的(de)基因(yin)(yin)。此外，在重癥患者中，差異(yi)基因(yin)(yin)與(yu)蛋白質(zhi)合成、粘合和運輸相關(guan)的(de)生物過程(cheng)相關(guan)。這些(xie)結果揭示了COVID-19患(huan)者(zhe)B細胞(bao)亞群的轉錄組特征。
7.重癥患者(zhe)B細胞(bao)擴(kuo)張與V(D)J基因特異性重排
研究者從BCR測序(xu)中重建(jian)了BCR序列，并分析了BCR克隆擴增的狀態。簡單地說，BCRs在(zai)每個(ge)集群中的檢出率都在(zai)75%以上。還發現(xian)，與其(qi)他三種情況(kuang)相比，重癥患者的B細(xi)胞表現出明(ming)顯(xian)的克隆性擴增(zeng)，說明(ming)重癥患者的B細胞活性和體(ti)液(ye)免疫應答被強烈激活。這(zhe)讓人想起(qi)其他(ta)研究者(zhe)以(yi)前的觀(guan)察(cha)結果(guo)，較高的抗(kang)體(ti)滴(di)度與較差(cha)的臨床(chuang)結果(guo)相關(guan)(guan)。這(zhe)引起(qi)了人們的關(guan)(guan)注，病(bing)原(yuan)體(ti)導向的抗(kang)體(ti)可(ke)以(yi)促進疾病(bing)病(bing)理，導致類似(si)于SARS觀察到的(de)抗體依賴增(zeng)強。
接下來，研(yan)究者分別評估了在中(zhong)度、重度和恢復(fu)期疾病患者中(zhong)IgA、IgD、IgG和IgM (IgE未檢測)的分布情況(kuang)。在(zai)大多數患者中，IgM是(shi)主(zhu)要的(de)免疫球蛋白。與HDs相比，COVID-19患者的IgG含量(liang)增加，而IgM含量(liang)減少。在恢復期患者(zhe)中(zhong)，IgG和IgM水平恢復到與HDs相(xiang)似的水平(ping)。
為了研究BCR的偏V(D)J重排，我(wo)們在四(si)種條件下比(bi)較了V(D)J基因的使用(yong)情(qing)(qing)況(kuang)。與(yu)其他三種(zhong)情(qing)(qing)況(kuang)相比，我們發(fa)現在(zai)嚴重情(qing)(qing)況(kuang)下B細胞的V(D)J使用更(geng)有特(te)異性，這表明(ming)在嚴重情況下B細胞可能經(jing)歷了獨特和特異(yi)性的V(D)J重排。還發現，IGHJ4在所有HDs和患者中都得到了廣(guang)泛(fan)的應用(yong)，但與(yu)其(qi)他三種情況下的患者相比，IGHJ4的(de)配對IGHV基因在重(zhong)癥患者中是(shi)不同的。還觀察到(dao)重(zhong)度患者中IGHV3-7的過度(du)表達。此外，在重癥患者中V-J頻率最(zui)高(gao)的(de)兩對分(fen)別是IGHV3-7/IGHJ4和IGKV3-15/IGKJ3。綜上所述，重(zhong)癥(zheng)患者的(de)B細(xi)胞克隆增加和IGHV和IGKJ基因的濫(lan)用提示SARS-CoV-2感染與宿主B細胞中的V(D)J重排有關。值得注意的(de)是(shi)，在(zai)重癥患者中選擇性使用顯性IGV基因，特別是IGHV3-7和IGKV3-15，可能有助于疫苗的設計(ji)。
五. 總結
綜上所述，本研究中對(dui)SARS-CoV-2感(gan)染的(de)(de)復雜動態免疫反應(ying)的(de)(de)綜合(he)多細(xi)胞描述奠定了基礎(chu)。這些(xie)數據，加(jia)上詳細(xi)的(de)(de)基于(yu)TCR和bcr的血統信息，可以為深入(ru)了解COVID-19患者外周血淋巴細(xi)胞(bao)提供豐(feng)富的資源，為合理設計治療方案和開發sars - cov -2特異性疫苗鋪平道(dao)路(lu)。