生命科學中的許多重大發現都是從細胞與生物功能密切相關性中認識到的。在發育生物學中，諸如子細胞之間的對稱破壞和細胞命運決定等中心主題都是基于細胞之間的空間關系。在臨床環境中，組織病理學常被用作一種結論性的診斷工具，正是因為許多疾病的特征是組織中的空間特異性。感染和炎癥過程可以徹底改變組織中的細胞結構。這些發現得到了包括原位雜交（ISH）和免疫組化在內的分子生物學方法的支持，這些方法通過繪制組織內的DNA、RNA和蛋白質，提供了更直接可視化的生物過程。然而，這些方法一次最多只能分析少量的基因或蛋白質。

“組(zu)學(xue)”革(ge)命(ming)深刻地改變(bian)(bian)了我們(men)描述細(xi)胞(bao)(bao)(bao)特征(zheng)的能力。新的方法可以檢測(ce)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)中的全基因組(zu)、轉錄組(zu)或蛋(dan)白(bai)質(zhi)組(zu)，而不僅僅是一些(xie)RNA或蛋(dan)白(bai)質(zhi)標(biao)記物。基因組(zu)測(ce)序、蛋(dan)白(bai)質(zhi)組(zu)學(xue)等分(fen)子(zi)圖譜技術已經改變(bian)(bian)了生(sheng)物醫學(xue)研究，但這些(xie)技術大多需要組(zu)織分(fen)離(li)，導(dao)致組(zu)織形態(tai)和(he)空(kong)(kong)間(jian)(jian)信息的丟(diu)失(shi)。空(kong)(kong)間(jian)(jian)分(fen)子(zi)圖譜技術的最新發展使得細(xi)胞(bao)(bao)(bao)能夠在保(bao)持其空(kong)(kong)間(jian)(jian)和(he)形態(tai)完整(zheng)的情況(kuang)下進行全面的分(fen)子(zi)表征(zheng)。分(fen)子(zi)圖譜數據(ju)生(sheng)成細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的遺傳、轉錄和(he)蛋(dan)白(bai)質(zhi)組(zu)的深層特征(zheng)，而組(zu)織圖像捕獲細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的空(kong)(kong)間(jian)(jian)位置和(he)形態(tai)特征(zheng)。

雖然空間轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)組(zu)學技(ji)術(shu)(shu)(shu)的關(guan)鍵(jian)，在(zai)可檢測(ce)基(ji)因的數(shu)量(liang)和可檢測(ce)組(zu)織(zhi)的大小方(fang)面存在(zai)很(hen)大差異，但本(ben)文重點(dian)討論了(le)能夠跨組(zu)織(zhi)區域進行轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)組(zu)水平檢測(ce)的技(ji)術(shu)(shu)(shu)。主要是(shi)空間轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)組(zu)技(ji)術(shu)(shu)(shu)：1)基(ji)于NGS技(ji)術(shu)(shu)(shu)，在(zai)NGS測(ce)序前將(jiang)位置信息編碼到轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)本(ben)上；2)基(ji)于成像的方(fang)法，包括原位測(ce)序（ISS）——轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)本(ben)在(zai)組(zu)織(zhi)中擴增和測(ce)序，和基(ji)于ISH的方(fang)法——成像探針在(zai)組(zu)織(zhi)中被連續雜交。這些不同(tong)的技(ji)術(shu)(shu)(shu)可以(yi)被看(kan)作是(shi)匯(hui)聚在(zai)一個(ge)基(ji)因表(biao)達矩陣(zhen)上，該矩陣(zhen)捕獲了(le)每個(ge)點(dian)（即一個(ge)像素、一個(ge)細胞或(huo)一組(zu)細胞）的轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)組(zu)。

1.    基于NGS技術的方法

2016年(nian)發表(biao)的(de)空間(jian)轉錄(lu)組學(xue)（ST）技(ji)術可(ke)以得到空間(jian)分(fen)辨的(de)全轉錄(lu)組信息。2018年(nian)底，ST技(ji)術被10x Genomics公司收購并進一步開發，命名為 "10x Visium"。10x Visium檢測(ce)法在分(fen)辨率(lv)（直徑55μm，條形碼區域之(zhi)間(jian)的(de)距離更小）以及運行時間(jian)上(shang)都有改(gai)進。

Slide-seq代替在玻片(pian)上打(da)印區域條(tiao)形(xing)碼(ma)(ma)RT引物，它利用(yong)(yong)放置在載玻片(pian)上的(de)(de)(de)隨(sui)機條(tiao)形(xing)碼(ma)(ma)珠子來捕獲mRNA。在Slide-seq方法(fa)發表(biao)后(hou)不久(jiu)，另(ling)一種使用(yong)(yong)更(geng)小(xiao)的(de)(de)(de)條(tiao)形(xing)碼(ma)(ma)珠子的(de)(de)(de)技(ji)術(shu)(shu)發布，命名為高分(fen)辨率空(kong)間轉錄組(zu)技(ji)術(shu)(shu)（HDST）。近期(qi)，開發了(le)一種可(ke)在組(zu)織中使用(yong)(yong)確定性條(tiao)形(xing)碼(ma)(ma)進行(xing)空(kong)間組(zu)測(ce)序（DBiT-seq）的(de)(de)(de)方法(fa)，該方法(fa)基于微流體的(de)(de)(de)方法(fa)將(jiang)條(tiao)形(xing)碼(ma)(ma)傳遞(di)到組(zu)織玻片(pian)的(de)(de)(de)表(biao)面(mian)，以(yi)實(shi)現10μm像素大小(xiao)的(de)(de)(de)分(fen)辨率。Stereo-seq使用(yong)(yong)隨(sui)機條(tiao)形(xing)碼(ma)(ma)DNA納米球沉積在陣(zhen)列(lie)模式中，以(yi)實(shi)現納米級分(fen)辨率。Seq-scope已經實(shi)現了(le)亞細胞(bao)分(fen)辨率的(de)(de)(de)空(kong)間條(tiao)形(xing)碼(ma)(ma)，可(ke)以(yi)用(yong)(yong)來可(ke)視化(hua)核和細胞(bao)質轉錄。

在所有基于(yu)NGS的方法中(zhong)，均為收集空間條形碼RNA并進行(xing)測(ce)序。每個(ge)reads的條形碼用于(yu)繪制空間位置，而測(ce)序reads的其余(yu)部(bu)分被映射到基因組，以識別轉錄源，共(gong)同生(sheng)成一個(ge)基因表達矩陣。

2. 基于成像的方法

本(ben)文介紹了(le)兩(liang)種(zhong)(zhong)主要的(de)(de)(de)(de)(de)(de)基于(yu)圖像(xiang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)空(kong)間轉(zhuan)(zhuan)錄組學方(fang)法(fa)：基于(yu)ISS和基于(yu)ISH的(de)(de)(de)(de)(de)(de)方(fang)法(fa)。基于(yu)ISS的(de)(de)(de)(de)(de)(de)方(fang)法(fa)直接讀(du)出組織內轉(zhuan)(zhuan)錄本(ben)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)序列。具體來說，RNA被逆(ni)轉(zhuan)(zhuan)錄，通過(guo)滾圈擴增，并(bing)(bing)進行測序。BaristaSeq是另一種(zhong)(zhong)基于(yu)缺口填充掛鎖的(de)(de)(de)(de)(de)(de)方(fang)法(fa)，其讀(du)取長度增加到15個(ge)(ge)堿基。STARmap使用條(tiao)形碼掛鎖探針(zhen)，與(yu)靶(ba)標雜交，通過(guo)添加第二個(ge)(ge)引(yin)物，針(zhen)對(dui)掛鎖探針(zhen)旁邊的(de)(de)(de)(de)(de)(de)位點，避(bi)(bi)免了(le)逆(ni)轉(zhuan)(zhuan)錄（RT）步驟(zou)。這種(zhong)(zhong)方(fang)法(fa)避(bi)(bi)免了(le)cDNA轉(zhuan)(zhuan)換的(de)(de)(de)(de)(de)(de)效率障礙，并(bing)(bing)通過(guo)增加第二個(ge)(ge)雜交步驟(zou)來降低(di)噪音。到目前為止，所提到的(de)(de)(de)(de)(de)(de)方(fang)法(fa)都是基于(yu)對(dui)靶(ba)標的(de)(de)(de)(de)(de)(de)先驗(yan)知識，FISSEQ是一種(zhong)(zhong)非(fei)靶(ba)標的(de)(de)(de)(de)(de)(de)方(fang)法(fa)，即捕獲所有種(zhong)(zhong)類的(de)(de)(de)(de)(de)(de)RNA。盡管非(fei)靶(ba)向擴增會導(dao)致光學擁擠和靈敏度降低(di)，但最近開發(fa)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)擴張(zhang)測序（ExSeq）已經證明其可以用于(yu)組織中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)非(fei)靶(ba)向ISS 。

基于(yu)ISH的方(fang)法(fa)是(shi)基于(yu)成像的第二類方(fang)法(fa)，以ISH技(ji)(ji)術(shu)為基礎，通過互補熒光探(tan)針(zhen)雜交檢測目標(biao)序列。smFISH利用多條短的寡核苷(gan)酸(suan)探(tan)針(zhen)（大約20 bp）來(lai)靶(ba)向同(tong)一mRNA轉錄(lu)本(ben)的不同(tong)區域。雖然smFISH具有高靈敏(min)度和(he)亞細胞空間(jian)分(fen)辨率，但由(you)于(yu)標(biao)準(zhun)顯微鏡中光譜重(zhong)疊的固有限(xian)制，它一次(ci)只能針(zhen)對(dui)幾(ji)個基因。seqFISH是(shi)一種多路(lu)smFISH方(fang)法(fa)，通過連續幾(ji)輪雜交、成像和(he)探(tan)針(zhen)剝(bo)離，多次(ci)檢測單(dan)(dan)(dan)個轉錄(lu)本(ben)。然而，雜交輪數的增加需要增加smFISH探(tan)針(zhen)的數量(liang)，這使得seqFISH既昂貴又耗(hao)時。為了彌補seqFISH的大量(liang)耗(hao)時，2015年發布(bu)了MERFISH技(ji)(ji)術(shu)。這種技(ji)(ji)術(shu)可以鑒(jian)定單(dan)(dan)(dan)個細胞中數千種RNA的拷貝數和(he)空間(jian)定位。它利用組(zu)合標(biao)簽、連續成像等技(ji)(ji)術(shu)來(lai)提高檢測通量(liang)，并通過二進制條形碼(ma)來(lai)抵消單(dan)(dan)(dan)分(fen)子標(biao)記和(he)檢測錯誤。

對于基(ji)于ISS和基(ji)于ISH的(de)方法，是(shi)用(yong)圖像(xiang)處理(li)(li)生成(cheng)基(ji)因表(biao)達矩陣(zhen)。為了獲得(de)細胞(bao)級(ji)矩陣(zhen)，要么(me)(me)手動分割(ge)(ge)小區域(yu)，要么(me)(me)系統(tong)地使用(yong)計算(suan)方法對圖像(xiang)進行分割(ge)(ge)。雖然這些可(ke)能并不符合(he)(he)真正(zheng)的(de)物理(li)(li)邊(bian)界，但它們完成(cheng)了將(jiang)每個mRNA分配給細胞(bao)的(de)任務(wu)。或者(zhe)，數據分析(xi)可(ke)以(yi)從單(dan)個像(xiang)素水平開始，并結合(he)(he)基(ji)因表(biao)達數據來描繪細胞(bao)。

空(kong)間轉錄(lu)組技術提供了一個基(ji)因表達(da)矩陣

由(you)于(yu)空間轉(zhuan)錄組(zu)技術提(ti)供了一個無偏的空間組(zu)成圖像，已被用(yong)于(yu)生成組(zu)織圖譜，作為參考提(ti)供了有價值(zhi)的資源。  

在神經生物學(xue)方(fang)面：基于空間轉錄(lu)組學(xue)的(de)方(fang)法已經建立了整個小(xiao)鼠大腦或特定(ding)區域的(de)詳(xiang)細圖譜，如(ru)視(shi)覺(jue)皮(pi)層(ceng)、初(chu)級運動(dong)皮(pi)層(ceng)、中(zhong)(zhong)顳回、下(xia)丘腦視(shi)前(qian)區、海馬和小(xiao)腦。相關研究在對背外側前(qian)額葉皮(pi)質的(de)分析(xi)中(zhong)(zhong)確定(ding)了已知精神分裂癥和孤獨癥相關基因的(de)空間模式，從而(er)提出了精神分裂癥遺(yi)傳易(yi)感性的(de)機制(zhi)。

在(zai)(zai)發育生物學中(zhong)：時間(jian)分(fen)辨的(de)(de)空間(jian)轉錄(lu)組圖譜有助于闡明心臟發育、精子發生和(he)(he)腸道發育的(de)(de)空間(jian)動(dong)力學。同樣，對人類子宮內膜(mo)在(zai)(zai)月經周(zhou)期的(de)(de)增(zeng)殖期和(he)(he)分(fen)泌期的(de)(de)全面研(yan)究(jiu)發現了(le)WNT和(he)(he)Notch信號在(zai)(zai)調節向纖毛或分(fen)泌型上皮細胞分(fen)化(hua)中(zhong)的(de)(de)作用。這些圖譜一直是合作項目(mu)協調努力的(de)(de)重點，為(wei)研(yan)究(jiu)界(jie)提供有效(xiao)資源，并得到Human Cell Atlas項目(mu)和(he)(he)Allen Institute for Brain Science的(de)(de)支持。

除了(le)(le)正常(chang)的(de)發(fa)育和(he)生(sheng)理之外，空(kong)(kong)間轉(zhuan)錄組(zu)(zu)(zu)(zu)學(xue)(xue)很適合研(yan)究(jiu)疾(ji)病中的(de)組(zu)(zu)(zu)(zu)織(zhi)結(jie)構(gou)紊(wen)亂。空(kong)(kong)間轉(zhuan)錄組(zu)(zu)(zu)(zu)學(xue)(xue)能夠(gou)識(shi)(shi)別在癌(ai)癥中起作用的(de)機制，即正常(chang)生(sheng)理功能的(de)組(zu)(zu)(zu)(zu)織(zhi)結(jie)構(gou)發(fa)生(sheng)改(gai)變。隨著人們對(dui)腫(zhong)瘤微環(huan)境重要性(xing)的(de)日益認識(shi)(shi)，空(kong)(kong)間轉(zhuan)錄組(zu)(zu)(zu)(zu)學(xue)(xue)已被(bei)用于(yu)研(yan)究(jiu)其與不同狀態癌(ai)細(xi)胞的(de)關系(xi)。特別是(shi)，空(kong)(kong)間轉(zhuan)錄組(zu)(zu)(zu)(zu)學(xue)(xue)能夠(gou)研(yan)究(jiu)癌(ai)癥和(he)正常(chang)組(zu)(zu)(zu)(zu)織(zhi)之間的(de)分子(zi)特征(zheng)。例(li)如，在皮膚(fu)鱗狀細(xi)胞癌(ai)中發(fa)現了(le)(le)免疫(yi)調(diao)節(jie)性(xing)癌(ai)細(xi)胞狀態。空(kong)(kong)間轉(zhuan)錄組(zu)(zu)(zu)(zu)學(xue)(xue)還為(wei)神經(jing)退(tui)行性(xing)疾(ji)病（包括阿爾茨海默病和(he)肌(ji)萎縮(suo)側索硬化(hua)癥）、感染和(he)炎(yan)癥過程(cheng)（如麻風病、流感和(he)敗血癥）以及風濕病（包括類風濕性(xing)關節(jie)炎(yan)和(he)脊柱關節(jie)炎(yan)）中組(zu)(zu)(zu)(zu)織(zhi)失調(diao)機制提供了(le)(le)見解。

空(kong)間(jian)轉錄組技術(shu)產(chan)生(sheng)了一個基(ji)因(yin)表達矩陣，對其進行(xing)分(fen)析既可(ke)以檢(jian)驗現有的(de)(de)(de)假(jia)設，也可(ke)以通(tong)過(guo)探索(suo)性分(fen)析產(chan)生(sheng)新的(de)(de)(de)觀察(cha)結果。鑒于空(kong)間(jian)轉錄組數(shu)據集(ji)的(de)(de)(de)復雜(za)性和高維(wei)(wei)度，采用一種開放的(de)(de)(de)思維(wei)(wei)方式，通(tong)過(guo)數(shu)據分(fen)析找到意想不(bu)到的(de)(de)(de)關(guan)系(xi)，可(ke)以產(chan)生(sheng)新的(de)(de)(de)理解。

分析空(kong)間(jian)(jian)轉錄組數(shu)據(ju)(ju)通(tong)(tong)常需要(yao)排除低質(zhi)量(liang)數(shu)據(ju)(ju)和(he)(he)基(ji)因表達矩陣(zhen)上的(de)(de)初始轉換，以(yi)提高信噪比，這(zhe)可(ke)以(yi)使(shi)用(yong)分析軟(ruan)件包（如Giotto、Seurat、STutility和(he)(he)stLearn）執行。平(ping)滑算法(fa)可(ke)應(ying)用(yong)于(yu)數(shu)據(ju)(ju)，以(yi)提高靈敏度，并消(xiao)除技術和(he)(he)生(sheng)物變(bian)化的(de)(de)不必要(yao)來源(yuan)。基(ji)于(yu)相(xiang)鄰點之間(jian)(jian)可(ke)以(yi)共享信息的(de)(de)前(qian)提，沿空(kong)間(jian)(jian)坐(zuo)標在(zai)移動窗口(kou)中平(ping)均物理相(xiang)鄰點之間(jian)(jian)的(de)(de)基(ji)因表達可(ke)以(yi)減(jian)少噪聲(sheng)。類(lei)似地，通(tong)(tong)過調(diao)整數(shu)據(ju)(ju)比例，使(shi)數(shu)據(ju)(ju)在(zai)不同(tong)(tong)點上具有相(xiang)同(tong)(tong)的(de)(de)平(ping)均值和(he)(he)方差（z-score），可(ke)以(yi)幫(bang)助(zhu)進行基(ji)因間(jian)(jian)的(de)(de)比較。

空間轉錄組數據集的探索性數據分析操(cao)作(zuo)示(shi)意圖

1. Cluster

聚類(lei)操作揭(jie)示了數據(ju)中的(de)結構(gou)，從最基(ji)本(ben)的(de)角(jiao)度定義(yi)了具有(you)(you)相(xiang)似(si)轉(zhuan)錄(lu)組的(de)點集，或正(zheng)交(jiao)地(di)，識別在(zai)點之間具有(you)(you)相(xiang)似(si)表達(da)模(mo)式(shi)的(de)基(ji)因。基(ji)因聚類(lei)，使用(yong)同樣的(de)方(fang)法，可以識別與(yu)細胞類(lei)型(xing)或細胞狀態相(xiang)對(dui)應的(de)共(gong)表達(da)基(ji)因模(mo)塊。目前正(zheng)在(zai)開(kai)發諸如BayesSpace之類(lei)的(de)聚類(lei)方(fang)法，這些方(fang)法側重于空間轉(zhuan)錄(lu)組學的(de)特(te)定特(te)征(zheng)。

2. Select

 典型的(de)(de)(de)空間(jian)轉錄組數據(ju)集(ji)包含的(de)(de)(de)生物信(xin)息比任(ren)何單一分析(xi)都要多。基因可(ke)以根(gen)據(ju)它們的(de)(de)(de)空間(jian)自相關性(使用(yong)Moran’s I或Geary’s C)、鄰域富集(ji)(例如，在(zai)BinSpect中)或熵(例如，在(zai)Haystack中)來評分。Trendsceek使用(yong)接近的(de)(de)(de)標記點(dian)處理(li)，能(neng)夠識別(bie)表達的(de)(de)(de)熱點(dian)和(he)梯度。SpatialDE利用(yong)高(gao)斯過(guo)程回歸(gui)將給定基因的(de)(de)(de)表達變異分解為空間(jian)和(he)非空間(jian)成分，SPARK也采用(yong)了(le)類似的(de)(de)(de)方(fang)法。

3. Score

雖然(ran)基因(yin)和spots是空間轉錄(lu)組(zu)學(xue)的主要觀察數(shu)(shu)據(ju)，但(dan)基礎生物學(xue)意(yi)味著基因(yin)作(zuo)為(wei)(wei)模(mo)塊共同表(biao)(biao)達，spots轉錄(lu)組(zu)反映有限(xian)的細(xi)胞類型(xing)和狀態。這(zhe)是評分(fen)函數(shu)(shu)的前提(ti)，評分(fen)函數(shu)(shu)用于將一(yi)(yi)組(zu)相似的點總(zong)結(jie)為(wei)(wei)單一(yi)(yi)基因(yin)表(biao)(biao)達譜，或正交地將一(yi)(yi)組(zu)連貫的基因(yin)總(zong)結(jie)為(wei)(wei)單一(yi)(yi)模(mo)式(shi)(shi)，以這(zhe)種方(fang)式(shi)(shi)總(zong)結(jie)數(shu)(shu)據(ju)可(ke)(ke)以識(shi)別(bie)功能特性。評分(fen)可(ke)(ke)以簡單地通過對(dui)集合的值求平均值來完(wan)成，或者(zhe)根據(ju)Seurat工作(zuo)流中實現的零模(mo)型(xing)對(dui)表(biao)(biao)達式(shi)(shi)進行(xing)評分(fen)。

4. Characterize

通(tong)過對(dui)空間轉錄組(zu)數(shu)據點群和(he)基(ji)因(yin)(yin)(yin)集(ji)的(de)(de)操作識別的(de)(de)對(dui)象，必須具(ju)有生物學(xue)理解和(he)解釋(shi)(shi)的(de)(de)特(te)征。要實現這一點，與其(qi)他(ta)數(shu)據源和(he)其(qi)他(ta)先驗知識的(de)(de)集(ji)成是必不(bu)可(ke)少的(de)(de)。當一個(ge)集(ji)群與一個(ge)組(zu)織(zhi)區域(yu)相匹配時，可(ke)以手動描述(shu)spots的(de)(de)特(te)征，如在MERFISH中注釋(shi)(shi)大腦中的(de)(de)單(dan)個(ge)細胞類型，在胰(yi)腺癌樣本(ben)中注釋(shi)(shi)腫瘤的(de)(de)正常和(he)惡性區域(yu)。通(tong)過識別一組(zu)標記基(ji)因(yin)(yin)(yin)并對(dui)其(qi)進行特(te)征描述(shu)，也可(ke)以間接地(di)對(dui)一個(ge)簇進行注釋(shi)(shi)。具(ju)體(ti)地(di)說，基(ji)因(yin)(yin)(yin)集(ji)可(ke)以通(tong)過量化其(qi)與注釋(shi)(shi)基(ji)因(yin)(yin)(yin)集(ji)的(de)(de)重疊來描述(shu)。這是多模(mo)式交叉分析(xi)（MIA）和(he)基(ji)因(yin)(yin)(yin)集(ji)富集(ji)分析(xi)（GSEA）的(de)(de)基(ji)礎(chu)，該分析(xi)可(ke)以從GO、KEGG、Hallmark 和(he)其(qi)他(ta)數(shu)據庫中查詢獲得。

5. Relate

鑒于其系(xi)(xi)(xi)統性，空(kong)(kong)間(jian)(jian)(jian)轉錄組學(xue)非(fei)常適(shi)合于識(shi)別基因(yin)群體和(he)組織區域(yu)之間(jian)(jian)(jian)的(de)(de)相(xiang)(xiang)似性、差(cha)異和(he)關(guan)系(xi)(xi)(xi)。點簇可(ke)以通(tong)過查詢(xun)表達基因(yin)、空(kong)(kong)間(jian)(jian)(jian)重疊、發(fa)(fa)育或(huo)功能關(guan)系(xi)(xi)(xi)而相(xiang)(xiang)互(hu)關(guan)聯。例如RNA velocity利用(yong)未切(qie)片(pian)的(de)(de)轉錄本來(lai)推斷(duan)斑點在時(shi)間(jian)(jian)(jian)上是(shi)如何(he)相(xiang)(xiang)互(hu)關(guan)聯的(de)(de)，并被應用(yong)于皮層來(lai)繪(hui)制神經發(fa)(fa)育的(de)(de)動力學(xue)圖譜。基于RNA-seq的(de)(de)拷貝數(shu)變異推斷(duan)識(shi)別染色體非(fei)整倍體，可(ke)用(yong)于區分惡性斑點和(he)非(fei)惡性斑點，并識(shi)別不同的(de)(de)亞克隆。當兩組點在空(kong)(kong)間(jian)(jian)(jian)上相(xiang)(xiang)鄰(lin)時(shi)，可(ke)以通(tong)過使用(yong)已知(zhi)數(shu)據(ju)庫（如CellPhoneDB或(huo)NicheNet）檢(jian)查它們的(de)(de)成(cheng)對受體和(he)配(pei)體來(lai)提出細(xi)胞之間(jian)(jian)(jian)的(de)(de)潛在相(xiang)(xiang)互(hu)作用(yong)模式。

數據(ju)分析操(cao)作路徑

健康或疾病(bing)組(zu)織(zhi)的空間轉(zhuan)錄(lu)組(zu)學(xue)圖譜自然有助(zhu)于無偏(pian)見的探(tan)(tan)索和假設生成(cheng)。即使是那些設計用(yong)于研究特定生物(wu)過(guo)程(cheng)的空間轉(zhuan)錄(lu)組(zu)數(shu)據(ju)集(ji)，如時間進程(cheng)研究或擾動實驗(yan)，也可(ke)以(yi)探(tan)(tan)索以(yi)揭示意(yi)想不(bu)到的變化(hua)并提出(chu)新的假說。從而利用(yong)數(shu)據(ju)集(ji)的高維性來產生可(ke)靠(kao)的生物(wu)推論。這些觀察到的細(xi)胞(bao)類型，基因(yin)表達的模式或兩種細(xi)胞(bao)狀態的共同定位可(ke)能推測一個新的可(ke)驗(yan)證的假設。

此(ci)外(wai)，空間轉(zhuan)(zhuan)錄組(zu)數據(ju)可以(yi)(yi)(yi)(yi)被納入(ru)經典的(de)(de)(de)(de)假設驅動的(de)(de)(de)(de)實(shi)(shi)驗(yan)設計(ji)中，使(shi)用充(chong)分有力的(de)(de)(de)(de)實(shi)(shi)驗(yan)來檢驗(yan)一個(ge)(ge)定義(yi)明確(que)的(de)(de)(de)(de)預測。事實(shi)(shi)上(shang)，隨著(zhu)空間轉(zhuan)(zhuan)錄技(ji)術(shu)變得更加容易，它已經準備好作為(wei)一種常(chang)規的(de)(de)(de)(de)檢測方法，與(yu)流式細胞儀(yi)或(huo)RNA測序相(xiang)提并論。在實(shi)(shi)驗(yan)設計(ji)的(de)(de)(de)(de)指導(dao)下(xia)，空間轉(zhuan)(zhuan)錄組(zu)學在作為(wei)擾(rao)動或(huo)時間歷程實(shi)(shi)驗(yan)的(de)(de)(de)(de)讀數時可以(yi)(yi)(yi)(yi)證(zheng)實(shi)(shi)或(huo)證(zheng)偽一個(ge)(ge)假設。每(mei)個(ge)(ge)樣本(ben)都可以(yi)(yi)(yi)(yi)由(you)一個(ge)(ge)單獨的(de)(de)(de)(de)數據(ju)點(dian)進(jin)行匯總，并在不同的(de)(de)(de)(de)重復(fu)和(he)條(tiao)(tiao)件(jian)下(xia)進(jin)行比(bi)較，因此(ci)需(xu)要收集足夠(gou)數量(liang)的(de)(de)(de)(de)數據(ju)，以(yi)(yi)(yi)(yi)確(que)保(bao)統(tong)計(ji)的(de)(de)(de)(de)嚴(yan)謹性(xing)(xing)和(he)有效性(xing)(xing)。研究(jiu)可能在同一樣本(ben)的(de)(de)(de)(de)多個(ge)(ge)切片上(shang)納入(ru)空間轉(zhuan)(zhuan)錄組(zu)學，以(yi)(yi)(yi)(yi)解釋技(ji)術(shu)變異性(xing)(xing)，或(huo)每(mei)個(ge)(ge)條(tiao)(tiao)件(jian)下(xia)的(de)(de)(de)(de)多個(ge)(ge)生(sheng)物重復(fu)。該假設可在模型系統(tong)、體(ti)外(wai)或(huo)體(ti)內或(huo)臨(lin)床(chuang)數據(ju)中進(jin)一步驗(yan)證(zheng)。

利用空間轉(zhuan)錄組學(xue)的假設生成和檢驗

隨著空間轉(zhuan)錄組(zu)技術的(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)辨(bian)率(lv)和(he)(he)靈(ling)敏(min)度的(de)(de)(de)(de)(de)(de)提(ti)(ti)高(gao)(gao)，與其他(ta)數(shu)據模(mo)式(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)集成可(ke)(ke)以為更好(hao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)組(zu)織表征提(ti)(ti)供機(ji)會。組(zu)織圖(tu)像(xiang)本身可(ke)(ke)以提(ti)(ti)取(qu)高(gao)(gao)分(fen)(fen)辨(bian)率(lv)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)信息，特(te)別(bie)(bie)是(shi)結合組(zu)織病(bing)(bing)理(li)學(xue)(xue)(xue)(xue)領域(yu)獲得(de)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)大(da)量知識(shi)來(lai)(lai)手動識(shi)別(bie)(bie)和(he)(he)注釋區域(yu)。在組(zu)織中檢測(ce)(ce)到的(de)(de)(de)(de)(de)(de)形態特(te)征，如細胞(bao)形狀或細胞(bao)核大(da)小，可(ke)(ke)以直接納入分(fen)(fen)析。在stLearn中，具(ju)有相似特(te)征的(de)(de)(de)(de)(de)(de)點(dian)被(bei)識(shi)別(bie)(bie)出來(lai)(lai)，用(yong)對物理(li)上接近而(er)且在構(gou)圖(tu)上相似的(de)(de)(de)(de)(de)(de)點(dian)進(jin)(jin)行平均的(de)(de)(de)(de)(de)(de)方法(fa)使空間平滑性得(de)以改(gai)進(jin)(jin)。另一(yi)項(xiang)研究則是(shi)通過將空間轉(zhuan)錄組(zu)基因(yin)表達數(shu)據與高(gao)(gao)分(fen)(fen)辨(bian)率(lv)組(zu)織學(xue)(xue)(xue)(xue)圖(tu)像(xiang)數(shu)據融合，提(ti)(ti)高(gao)(gao)其分(fen)(fen)辨(bian)率(lv)。深(shen)度學(xue)(xue)(xue)(xue)習也(ye)被(bei)用(yong)于(yu)(yu)(yu)預測(ce)(ce)來(lai)(lai)自基因(yin)表達和(he)(he)組(zu)織學(xue)(xue)(xue)(xue)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)細胞(bao)類型(xing)注釋，優(you)于(yu)(yu)(yu)單獨從(cong)任何(he)一(yi)種(zhong)方式(shi)預測(ce)(ce)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)注釋。隨著可(ke)(ke)用(yong)于(yu)(yu)(yu)訓練(lian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)錄組(zu)學(xue)(xue)(xue)(xue)數(shu)據的(de)(de)(de)(de)(de)(de)增加，機(ji)器學(xue)(xue)(xue)(xue)習算法(fa)也(ye)被(bei)用(yong)于(yu)(yu)(yu)預測(ce)(ce)組(zu)織病(bing)(bing)理(li)學(xue)(xue)(xue)(xue)圖(tu)像(xiang)中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)基因(yin)表達。這些算法(fa)不依賴于(yu)(yu)(yu)預先定義(yi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)形態特(te)征，而(er)是(shi)通過將整個圖(tu)像(xiang)分(fen)(fen)解來(lai)(lai)提(ti)(ti)高(gao)(gao)性能。將空間轉(zhuan)錄組(zu)學(xue)(xue)(xue)(xue)與機(ji)器學(xue)(xue)(xue)(xue)習方法(fa)相結合，可(ke)(ke)以提(ti)(ti)高(gao)(gao)組(zu)織病(bing)(bing)理(li)學(xue)(xue)(xue)(xue)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)(ke)解釋性，并在臨床決(jue)策中指導治療(liao)和(he)(he)告(gao)知預后。

在亞細胞分辨率下，染色質的(de)空(kong)間(jian)(jian)(jian)結構可能為(wei)不同環境下基因表(biao)達的(de)調控提供線索(suo)。將空(kong)間(jian)(jian)(jian)轉(zhuan)錄組(zu)(zu)(zu)數據集與基因組(zu)(zu)(zu)原位高通量成像以及組(zu)(zu)(zu)織(zhi)中組(zu)(zu)(zu)蛋白標記的(de)空(kong)間(jian)(jian)(jian)分布相結合將是非常有價值的(de)。最近(jin)，利(li)用完整組(zu)(zu)(zu)織(zhi)內同步DNA測序(xu)的(de)基因組(zu)(zu)(zu)組(zu)(zu)(zu)織(zhi)進行空(kong)間(jian)(jian)(jian)制圖已經(jing)成為(wei)可能。這表(biao)明(ming)，將空(kong)間(jian)(jian)(jian)基因組(zu)(zu)(zu)測序(xu)與原位轉(zhuan)錄組(zu)(zu)(zu)分析相結合的(de)目標可能即將實現(xian)，從(cong)而(er)加深我們對基因組(zu)(zu)(zu)組(zu)(zu)(zu)織(zhi)和功能編碼方式的(de)理解。

用蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)聯(lian)合檢測(ce)等補(bu)充方(fang)(fang)式來(lai)增強基(ji)因表達數據，也可(ke)以闡明(ming)空間轉(zhuan)(zhuan)錄組(zu)(zu)學沒有捕捉到的(de)過程，如(ru)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)的(de)翻譯后修飾和亞細(xi)胞定位及其在疾病中(zhong)的(de)失調(diao)。靶向(xiang)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)聯(lian)合檢測(ce)可(ke)與空間轉(zhuan)(zhuan)錄組(zu)(zu)學同(tong)時進行(xing)，在同(tong)一組(zu)(zu)織切片(pian)上使用免疫染色，如(ru)Visium所支(zhi)持的(de)那樣(yang)。DBiT-seq使用抗體衍(yan)生的(de)DNA標(biao)簽(qian)實現組(zu)(zu)織中(zhong)mRNA和蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)的(de)共(gong)映射。用于(yu)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)檢測(ce)的(de)高通量(liang)空間方(fang)(fang)法，如(ru)MIBI、CODEX、t-cyCIF和自動質(zhi)譜分析(xi)，為組(zu)(zu)織切片(pian)內的(de)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)組(zu)(zu)提供了無(wu)與倫比的(de)快照。將這些高通量(liang)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)組(zu)(zu)學方(fang)(fang)法與空間轉(zhuan)(zhuan)錄組(zu)(zu)學相結合的(de)技術進步將極大地(di)提高我們研(yan)究組(zu)(zu)織復雜(za)性的(de)能力。

 隨著技術的(de)(de)(de)(de)(de)不(bu)斷更新(xin)，空(kong)間轉錄(lu)組(zu)(zu)(zu)(zu)學(xue)(xue)領域(yu)正以(yi)指(zhi)數(shu)級的(de)(de)(de)(de)(de)速(su)度增長。目(mu)前空(kong)間轉錄(lu)組(zu)(zu)(zu)(zu)學(xue)(xue)方法面臨的(de)(de)(de)(de)(de)挑(tiao)戰，包(bao)括分(fen)辨率和靈(ling)敏度的(de)(de)(de)(de)(de)限(xian)制，以(yi)及通量和可(ke)(ke)獲(huo)得性(xing)正在被迅(xun)速(su)克(ke)服。空(kong)間轉錄(lu)組(zu)(zu)(zu)(zu)學(xue)(xue)方法與石蠟(la)包(bao)埋組(zu)(zu)(zu)(zu)織兼容，為回顧分(fen)析(xi)幾十(shi)年(nian)來(lai)收集的(de)(de)(de)(de)(de)樣本打開了大門。隨著未來(lai)的(de)(de)(de)(de)(de)創新(xin)，有可(ke)(ke)能系(xi)統性(xing)地(di)分(fen)析(xi)更大的(de)(de)(de)(de)(de)組(zu)(zu)(zu)(zu)織區域(yu)，以(yi)重建3D器官或生(sheng)物體水平的(de)(de)(de)(de)(de)圖譜，并(bing)將轉錄(lu)組(zu)(zu)(zu)(zu)范圍(wei)內(nei)的(de)(de)(de)(de)(de)基因(yin)表達變化隨著時間的(de)(de)(de)(de)(de)推移進行可(ke)(ke)視化。除了克(ke)服這(zhe)些技術上的(de)(de)(de)(de)(de)挑(tiao)戰，未來(lai)的(de)(de)(de)(de)(de)工(gong)作還需要開發新(xin)的(de)(de)(de)(de)(de)計算工(gong)具和創造性(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)析(xi)思維。這(zhe)些將使數(shu)據探(tan)索能夠識(shi)別空(kong)間模式(空(kong)間轉錄(lu)組(zu)(zu)(zu)(zu)數(shu)據集的(de)(de)(de)(de)(de)核心特征)，并(bing)揭示潛在生(sheng)物學(xue)(xue)的(de)(de)(de)(de)(de)見解。

 人類基因組(zu)(zu)初稿于(yu)2001年發表，為研究(jiu)遺傳(chuan)變異(yi)的來源和結(jie)果提供了參考。然而，基因組(zu)(zu)不同區域的功能(neng)和調控(kong)仍(reng)在積極(ji)研究(jiu)中。繪制每個基因在空間的表達(da)水平圖譜只(zhi)是(shi)闡明組(zu)(zu)織生(sheng)物學(xue)的組(zu)(zu)織原(yuan)則(ze)的第一步。正是(shi)這(zhe)些高分辨率細(xi)胞圖譜與無假設查詢(xun)的耦合，將有助(zhu)于(yu)獲得新(xin)的見解(jie)并(bing)揭(jie)示生(sheng)理學(xue)和疾(ji)病中組(zu)(zu)織結(jie)構的顯著特征。

這一(yi)領域(yu)的(de)(de)一(yi)個關鍵(jian)挑戰(zhan)將(jiang)是迭代構建一(yi)個多(duo)細胞空間模(mo)式。這些更(geng)深刻的(de)(de)生物(wu)學見解將(jiang)把我(wo)們(men)(men)對簡單組(zu)織(zhi)的(de)(de)理解擴展(zhan)到更(geng)復雜(za)的(de)(de)結構，包括發育中的(de)(de)生物(wu)體和患(huan)病組(zu)織(zhi)，使我(wo)們(men)(men)更(geng)接近于征服空間前(qian)沿。

1. 基因通量

基于(yu)(yu)NGS的方法是無(wu)偏(pian)向(xiang)性的，因為它們捕獲所(suo)有多(duo)聚(ju)腺苷酸(suan)化的轉錄(lu)本，因此非(fei)常適合(he)探索(suo)新的系統(tong)。相(xiang)比之下，ISH和大多(duo)數(shu)基于(yu)(yu)ISS的方法（FISSEQ和ExSeq除外(wai)）是有針對性的，需(xu)要對感(gan)興(xing)趣(qu)的基因有先(xian)驗(yan)知識(shi)。盡管如(ru)此，這(zhe)些方法的通量近年來有所(suo)增加，達到了10,000個(ge)基因。靶向(xiang)的空間轉錄(lu)組學方法也可以與(yu)scRNA-seq結合(he)使用，這(zhe)樣(yang)就可以更精確地定位已經識(shi)別的感(gan)興(xing)趣(qu)的基因。此外(wai)，非(fei)多(duo)聚(ju)腺苷酸(suan)化轉錄(lu)物的探針可用于(yu)(yu)查(cha)詢(xun)其(qi)他RNA，如(ru)成熟的microRNA和tRNA。

2. 序列信息

基于NGS和ISS的方(fang)法(fa)能夠檢測(ce)融合(he)轉錄物、剪(jian)接異構體和單核苷酸(suan)變(bian)體及點(dian)突變(bian)。當與基因表達矩(ju)陣結合(he)時，這些(xie)數(shu)據可以(yi)通過(guo)RNA速(su)度或譜系追蹤(zong)幫(bang)助重建時間過(guo)程。

3. 靈敏度

基于ISH的方法靈敏度高，相對于金標準單分子熒光ISH (smFISH)，最近達到了80%的檢測效率。NGS-based方法的靈敏度明顯較低，仍然低于scRNA-seq，但正在迅速提高到大約100個獨特的轉錄本/μm²。通(tong)常(chang)在敏(min)感性(xing)和基因通(tong)量之間存(cun)在一種權衡，正如相(xiang)對于(yu)非偏倚方法而(er)言(yan)，基于(yu)ISS的(de)靶(ba)向方法具有更高的(de)敏(min)感性(xing)。

4. 分辨率

原位方法(fa)的(de)分(fen)辨(bian)率(lv)(lv)僅受光學(xue)衍(yan)射(she)極限的(de)限制，在擴張(zhang)顯(xian)微鏡下，分(fen)辨(bian)率(lv)(lv)已達(da)到(dao)100 nm左右。因此，這些方法(fa)非常適用于有關亞細胞組織的(de)問題。基于NGS的(de)方法(fa)受限于spots的(de)直徑，但其分(fen)辨(bian)率(lv)(lv)自(zi)最(zui)初(chu)的(de)方法(fa)以來迅速提高，最(zui)近達(da)到(dao)約(yue)1μm。

5. 尺寸范圍

盡管在組織大小和成像時間之間存在權衡，但原位方法可以跨越廣泛的尺寸范圍。相比之下，基于NGS的方法是標準化的，陣列大小約為10mm²（目前商用的10x Genomics Visium為5mm²），這(zhe)可能不適(shi)用于較小或較大的(de)樣本。

6. 可行性

盡管這些(xie)技(ji)術(shu)非常(chang)強(qiang)大(da)，但它們(men)的(de)廣(guang)泛應用(yong)仍存在障礙(ai)，包括獲(huo)得用(yong)于(yu)原(yuan)位(wei)方(fang)法的(de)單分子成像，以及用(yong)于(yu)基于(yu)NGS方(fang)法的(de)捕獲(huo)陣列的(de)制造。商業化在某些(xie)情況下(xia)促進(jin)了這些(xie)技(ji)術(shu)的(de)應用(yong)，如10x Genomics Visium。 

參考文獻

Rao A, Barkley D, Fran?a GS, Yanai I. Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics. Nature. 2021; 596(7871): 211-220.